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    行業新聞
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    如何有效的開展動物睡眠剝奪實驗呢?

    雖然早已知道,睡眠在人類及哺乳animal的生命活動中具有十分重要的生理意義,但迄今為止,睡眠發生的確切機制卻尚未完全闡明。根據睡眠時的腦電圖、肌電圖及眼球運動表現,可將睡眠分為非快速眼球運動睡眠( nonrapid eye movements,NREM)和快速眼球運動睡眠( rapid eye movement,REM)或快波睡眠。睡眠剝奪( sleep deprivation)是研究睡眠的功能與發生機制的重要方法,睡眠剝奪模型的選擇,將直接影響睡眠剝奪實驗的可靠性及準確性,對睡眠剝奪實驗結果具有重要的影響,F將幾種常用的rat睡眠剝奪模型的方法、評價及進展情況綜述如下。

    1 平臺睡眠剝奪技術( platform technique)

    此類方法又稱為花瓶技術( flower pot technique),主要是利用rat畏水及在水中無法進入睡眠的生活習性,通過在盛水的水槽中放置平臺,讓rat站立在平臺上,因平臺直徑足夠。ㄖ睆6.5cm或更。,當rat進入REM時,因全身肌張力降低引起節律性低頭、觸水,以此來達到剝奪REM的目的。此類方法簡單易行,無需復雜昂貴的設備,在不同條件的實驗室均能開展,因而應用廣泛。其主要用來剝奪rat的REM,可分為以下三種方法:

    1.1 單平臺睡眠剝奪法( single platform method,SP)

    此方法最早于1964年由 Jouvet等應用在貓的睡眠剝奪實驗中,不久以后, Cohen將此方法應用于rat的睡眠剝奪實驗。方法為將一圓柱形小平臺(直徑約65mm),放置在長400mmx寬340mmx高160mm的水槽中,往水槽中加水,至平臺露出水面約10mm,將1只rat置于小平臺上,rat可在平臺上站立,可入NREM。當rat進入REM時,全身骨骼肌張力明顯降低,頸部肌張力降低引起節律性低頭、觸水,從而無法進人REM。采用SP實驗可引起animal的體重及胸腺重量減輕、腎上腺重量增加、血漿中腎上腺皮質酮(CORT)增加、animal攻擊行為增加、機體免疫反應抑制等。因SP是單只rat進行實驗,且在實驗中rat的活動空間受限,故有學者認為以上的臨床與實驗室表現可能與rat的群體隔離或活動空間受限有關。進一步研究發現,在實驗前群體飼養的animal,當與群體隔離后也會出現攻擊行為增加、血漿中CORT增加、免疫功能抑制等表現,rat活動空間受限也可引起血漿中CORT的水平的增加。這些結果與單平臺睡眠剝奪實驗中見到的類似。為克服SP中rat與群體分離及活動空間受限的缺點,在SP基礎上進一步發展為多平臺睡眠剝奪法。

    1.2多平臺睡眠奪法( multiple platform method,MP)

    MP法由 Van Hulzen等于1981年最先應用在rat睡眠剝奪實驗中。在MP中,為擴展rat的活動空間,將小平臺由SP中的1個增加至7個,仍將1只rat放在小平臺間進行睡眠剝奪試驗。因rat可以在7個小平臺間自由活動,故活動范圍較SP中有明顯增大。經實驗比較,在MP中,反映應激增強的一些指標,如腎上腺重量增加和胸腺重量減少仍然存在,甚至在rat血液中 ACTH,CORT的增加及腎上腺重量的增加較SP的更高,提示MP較SP有更強的應激性?紤]到rat為群居animal,單只rat實驗易導致與所在群體的隔離。為克服群體隔離所帶來的應激反應,有學者將MP法進一步改良,發展為改良多平臺睡眠剝奪法。

    1.3 改良多平臺睡眠剝奪法( modified multiple platform method, MMPM)

    在MMPM中,將10只rat(具體數目可根據實際需要確定)同時放在裝有14或15個小平臺的水槽中(長127cmx寬44cmx高45cm)進行實驗,這樣既避免了SP、MP中單只rat與群體隔離的缺點,又保留了MP中活動范圍增大的特點。因在實驗時rat多是3只或4只一籠進行飼養,如1組實驗需10只rat,則需要3籠或4絕rat?紤]到來自不同籠中飼養2周,實驗時再將這些rat放在一起同時進行睡眠剝奪實驗,這樣以克服實驗時rat群體不穩定的缺點,從而將實驗時的不確定因素減至最低。實驗研究發現,在MMPM中,經采取措施保持rat群體穩定性及避免rat與群體分離后,rat腎上腺重量、體重減輕量、血清中促腎上腺皮質激素(ACTH)和腎上腺皮質酮(CORT)的含量均較MP中為低,提示MMPM較MP具有更低的應激性,是較為理想的REM剝奪方法。

    2 強迫運動睡眼剝奪法( forced locomotion technique)

    此類睡眠剝奪方法形式多樣,在腦電監護情況下可行全部的睡眠剝奪( total sleep deprivation,TSD)和選擇性的睡眠剝奪( selective sleep deprivation,SSD)其共同特點是通過動力裝置,迫使rat不停地運動,從而達到睡眠剝奪的目的。此類方法的優點是睡眠剝奪效果明顯,睡眠剝奪的時間及強度易于掌、重復性好,無須實驗人員隨時觀察實驗情況,減輕了實驗人員工作強度。缺點是長時間運動引起機體的一系列應激反應,可能干擾睡眠剝奪的實驗結果,F選取其中兩種有代表意義的方法介紹如下。

    2.1水平轉盤睡眠剝奪法( large round horizontal platform method)

    此方法應用廣泛,又稱為disk-over- water method、由 Rechtschaffen等于1983年最先應用在睡眠剝奪實驗中。實驗裝置由一個電腦控制臺、一個水平轉盤及兩個開放的長方形有機玻璃缸組成。轉盤直徑為46cm,在電腦控制下可以按順時針、逆時針方向隨機水平轉動。兩只有機玻璃缸的尺寸均為長60cmx寬20.5cmx高60cm,在距離缸底5cm處的缸側壁開有一條縫隙,使轉盤的一半能分別從縫隙伸入兩只玻璃缸中,并能隨意轉動。缸底留置水約2cm深,轉盤離水面約3cm。實驗前1周將睡眠剝奪rat頭頸部植入微電極,并將微電極與電腦控制臺相連。將rat放在轉盤上適應環境1周,每天約1h,讓rat習慣在轉盤上活動、進水、進食等。實驗時將實驗組的rat及對照組的rat分別置于兩只缸中的轉盤上,當電腦通過微電極監測到實驗組rat進入慢波或快波睡眠的腦電信號后,立即發出指令使轉盤轉動6s(6s內轉動1/3圈),當rat被轉到玻璃缸壁時,因被玻璃缸壁擋住而可能掉入水中。每次在實驗組睡眠剝奪rat進人睡眠時轉盤即轉動6s,方向隨機,轉盤轉動時兩只rat均被動地隨著轉盤移動。此方法一次只剝奪一只rat睡眠,當實驗組的睡眠剝奪rat在運動,進食時,轉盤并不轉動,而此時對照組的rat則可以趁機睡覺,以彌補被剝奪的睡眠。此方法中睡眠剝奪組rat與對照組rat條件極其相似,因而可減少因實驗條件不同而所致的應激反應,可進行TSD和SSD實驗。

    2.2 旋轉圓筒睡眠剝奪法( rotating drum method)

    此方法于1979年由 Alexander等最先應用于睡眠剝奪實驗中。設備主要由一柱形圓筒及一小型慢速馬達構成。圓筒直徑30cm,高30cm,圓筒底由PVC(聚氯乙烯)構成,側壁由直徑為10.4mm的PVC桿圍成,桿長度30cm,桿之間間隔15.5mm,圓筒與小型馬達相連,馬達轉速為每45s轉1圈(也有學者應用每min轉1圈)。至少在實驗前2d,每天將rat放入圓筒中適應環境1次,適應時間不少于3h。實驗時將馬達按45s1圈進行勻速轉動,通過圓筒的轉動帶動rat不停運動而達到睡眠剝奪的目的。此類方法簡單易行,睡眠剝奪效果明顯,缺點是長時間不停運動,可引起機體的運動后應激反應及身體疲勞,可能干擾睡眠剝奪實驗結果。此類方法發展出多種變化Marcos等在進行新生rat睡眠剝奪時將簡旋轉速調節至2-3 r/min,后期逐漸增加至6-7 r/min, Shen等將圓筒在30s內旋轉180°,每5min旋轉一次以達到睡眠剝奪的目的。

     3 輕柔刺激法( method of gentle handling)

          此方法在短期的睡眠剝奪實驗中應用較多。當實驗人員通過觀察rat行為或通過腦電波監護觀察到rat進入睡眠時,通過輕輕拍打rat籠子,或應用聲音、光線的刺激促使rat保持清醒,必要時還可用紙卷、鉛筆或用手直接觸摸rat,使rat無法進入睡眠。注意不能將rat移出籠外。此方法簡單易行,在腦電監護情況下可進行TSD或SSD實驗。在無腦電監護時,需要實驗人員在旁不間斷觀察rat行為,易導致實驗人員的睡眠剝奪,故較適合較短時間的睡眠剝奪實驗。

     4 藥物睡眠剝奪法

          定時給rat注射藥物(多為一些中樞興奮藥),也可剝奪部分或全部睡眠,如注射咖啡因、去氧麻黃堿、特殊的神經毒素(DSP-4)、可樂定等。此類方法簡單易行,操作方便,不需要特殊儀器。缺點是rat存在個體差異,睡眠剝奪的效果及程度及不易掌握。多用在研究某些特殊藥物藥理作用的實驗中。

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